李小宁１，李 军１，尹杨燕２，李常挺１，马春霞１，陶 立１，龚 俞３，
钟舒红１，白慧丽１，彭 昊１ ，廖玉英１
（１．广西壮族自治区兽医研究所，广西兽医生物技术重点实验室，南宁５３０００１；２．广西大学动物科学技术学院，南宁５３０００４；３．贵州省畜禽遗传资源管理站，贵阳５５０００１）
摘 要：【目的】筛选新型广谱有效的抑菌蛋白，为全面解析植物乳杆菌抑菌机制和开发新型抗菌制剂奠定基础。【方法】以植物乳杆菌ＧＸ２０２００４１７－１为研究对象，采用牛津杯法测定其抑菌活性，以低温离心和超滤法初步分离获得胞外蛋白并测定其抑菌活性，对胞外蛋白进行不同温度、ｐＨ及蛋白酶处理，研究抑菌蛋白理化特性，利用液相色谱串联质谱（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）进一步分析鉴定植物乳杆菌代谢产物中的抑菌成分。【结果】植物乳杆菌ＧＸ２０２００４１７－１对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有良好的抑菌作用；发酵上清液在发酵２４ｈ的抑菌能力最强；胞外蛋白的抑菌能力与发酵上清液相近；植物乳杆菌抑菌蛋白具有较好的耐热特性，与对照组相比，在２０～８０℃时抑菌活性均无显著变化（Ｐ＜０．０５），在ｐＨ ６．０～８．０时抑菌活性最佳，对蛋白酶敏感；经ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ鉴定分析，检测出５种可信度较高且与抑菌作用相关的蛋白质，分别是片球菌素ｐｅｄｉｏｃｉｎ ＰＡ－１、溶菌素（ｌｙｓｉｎ）、聚酮合酶（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ）、辅助蛋白（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）和ＬｙｓＭ ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，分子质量分别为５．３４８、７．３４８、８．３４８、６．３４８和１９．６６２ｋｕ；蛋白质功能分析结果表明，片球菌素ｐｅｄｉｏｃｉｎ ＰＡ－１与溶菌素主要通过破坏细菌细胞壁与细胞膜，从而达到抑菌效果。ＬｙｓＭ ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ可识别含有Ｎ－乙酰氨基葡萄糖（ＧｌｃＮＡｃ）残基的肽聚糖，上调抗菌肽的表达；辅助蛋白主要参与细菌素的合成，聚酮合酶主要参与抗生素的合成，二者通过参与抑菌物质的合成间接发挥抑菌作用。【结论】本研究成功分离并鉴定植物乳杆菌ＧＸ２０２００４１７－１的５种抑菌蛋白；植物乳杆菌ＧＸ２０２００４１７－１可能通过其代谢产物中的多种抑菌蛋白协同发挥抗菌作用。
关键词：植物乳杆菌；抑菌蛋白；超滤法；液相色谱串联质谱；抑菌机制